Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒

產品描述

Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒（Quick Cell qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原體特異性引物和支原體特異性熒光探針（報告基因為FAM），用于對樣品的支原體基因組DNA進行熒光定量PCR擴增檢測。試劑盒內同時含有內參對照質粒mycoIC2和相應的引物和熒光探針（報告基因為VIC），用于監控支原體DNA提取和qPCR擴增的效率。本試劑盒可用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：體外細胞培養的上清、血清、各種體液（如唾液、尿液、鼻腔分泌物）、別的液體樣品。

經多次測試，本試劑盒有記錄可以識別在體外細胞培養中曾經報道出現的20種支原體。根據文獻報道，這些支原體基本上占污染細胞的支原體種類的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。

訂購信息

產品組分

注：①本試劑盒由于含有內參質粒mycoIC2（用于監控支原體DNA提取和qPCR擴增的有效性），客戶可以選擇進行樣品支原體DNA的提取（內參質粒mycoIC2在支原體DNA提取過程中加入），也可以選擇不進行樣品支原體DNA的提取（內參質粒mycoIC2在配制體系時加入）。

②本試劑盒的配套儀器可以是任何具有FAM和VIC檢測通道的熒光定量PCR儀。

運輸與保存

藍冰運輸。-20℃避光保存，有效期60個月。

使用方法

1.       待測樣品的前處理

為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品需要取自換液后培養2-3d且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長2-3d再取培養液進行檢測。可以按照以下兩種方法之一進行樣品的前處理：

1.1 方法一：對樣品進行支原體DNA的提取

很多樣品（比如：培養很多天的細胞上清、血清、血漿等）由于含有抑制PCR擴增的成分，如果樣品不進行前處理而直接檢測，有可能導致qPCR擴增失敗（qPCR結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線）。該類樣品建議客戶進行樣品DNA提取（或者離心清洗，見后文方法二）后，再進行檢測。提取DNA的過程有兩個作用：(1)  基本可以去除所有抑制PCR擴增的成分，保證后續定量PCR擴增的正常進行；（2）具有濃縮支原體DNA的作用，可以提高相對檢測靈敏度10-100倍。

1.2  方法二：樣品不經DNA提取

推薦此方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高相對檢測靈敏度，還可以去除絕大部分可能的抑制物，PCR擴增被抑制的可能性極低。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除抑制物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法。具體方法如下：

(1)  根據濃縮倍數，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 min，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。

(2)  將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心10 min，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻（如果最初使用了1500 μL的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍）。

(3)  至此，該樣品可以直接進行檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 min（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 sec）后，取上清進行檢測。

注1:這里的細胞培養上清不是指細胞經胰*消化后的離心上清，而是指至少培養2d后的貼壁細胞培養液上清（不需要胰*消化，也不能取經胰*消化后的離心上清進行檢測）或懸浮細胞培養液。

注2:本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會。如果錯誤使用更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來，從而導致假陰性。

注3:收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月，在-80℃可以長期保存。此外，為了節約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2.       熒光定量PCR體系的配制

本步驟所有操作強烈建議使用進口濾芯吸頭（比如Axygen濾芯吸頭）進行操作，以避免試劑被污染。操作之前，請認真看完后文的注意事項后，再進行操作：

將探針法溶液1P、陽性支原體DNA、去離子水、內參質粒mycoIC2從-20 ℃冰箱中取出，放室溫融化（也可以用手握住幫助融化）。探針法溶液1P和探針法溶液2T開蓋之前，請高速離心一下（5000 rpm，離心1min）。探針法溶液2T不能在室溫長久放置（可以短時間放置5-10min），建議在-20 ℃冰箱直接吸取。

如果樣品總數為N（N=待測樣品數+1個陽性對照+1個陰性對照），待測樣品的前處理方法不同，對應的反應體系也不同，具體如下：

2.1樣品進行DNA提取后的反應體系

在DNA提取過程中，必須按說明書加入內參質粒mycoIC2。如果提取時沒有加入內參質粒mycoIC2，則按照后文“樣品不經DNA提取的反應體系"進行操作：

(1)  反應體系：

表1. 樣品經DNA提取后的反應體系

注：總體積中多配制6%（該比例如果覺得不合適，可以自己調整），是為了防止移液誤差，以保證每個反應管中的反應液足量。

例：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。探針法溶液1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL。

(2)  將上述2種溶液混合，吹打均勻后，按每管12 μL分裝到熒光定量PCR八聯管中。

(3)  待測樣品管加入18 μL提取好的待測樣品DNA（樣品DNA加入量不能減少，否則內參質粒擴增可能失敗）；陰性對照管加入2 μL內參質粒mycoIC2（吹吸均勻后加入）和16 μL去離子水（為防止去離子水被污染，此處建議使用20 μL移液槍配合200 μL吸頭進行吸取操作）；陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA（吹吸均勻后加入）和16 μL去離子水。每管反應液的總體積為30 μL。

2.2 樣品不經DNA提取的反應體系：

(1)  反應體系：

表3. 內參質粒mycoIC2統一在配制PCR反應體系時加入

注：總體積中多配制6%（該比例如果覺得不合適，可以自己調整），是為了防止移液誤差，以保證每個反應管中的反應液足量。

例：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。去離子水的總體積為14×10×1.06=148.4 μL，探針法溶液1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL，內參質粒mycoIC2的總體積為2×10×1.06=21.2 μL。

(2)  將上述3種溶液混合，吹打均勻后，按每管28  μL分裝到熒光定量PCR八聯管中。

(3)  待測樣品管加入2 μL待測樣品DNA，陰性對照管加入2 μL去離子水，陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA（吹吸均勻后加入）。每管反應液的總體積為30 μL。

(4)  蓋上熒光定量PCR八聯管蓋子，去除反應管中的大氣泡，3000-6000 rpm離心30 sec。

注：定量PCR八聯管的封蓋，應該佩戴全新的PE手套進行操作，避免裸手接觸定量PCR八聯管。

3.       實時熒光定量PCR擴增：

將PCR八聯管放入熒光定量PCR儀內，設置如下實時熒光定量PCR擴增程序：

表3. 熒光定量PCR擴增程序

注：支原體檢測熒光通道選擇FAM（Reporter: FAM，Quencher: None）；內參對照檢測熒光通道選擇VIC（Reporter: VIC, Quencher: None）；反應體積（Sample Volume）為30 μL；參考熒光（Passive Reference，只有ABI儀器需要設置）選擇None。

4.       結果分析：

4.1 ABI StepOne Plus 熒光定量PCR儀基線和閾值設定方法

其他熒光定量PCR儀的設置大同小異，請參考各自儀器說明書進行設置。

(1)  基線（Baseline）的設定：可以將Auto baseline前面的√ 去掉，然后手動設置基線的起點為2（將剛開始熒光值不穩定的幾個循環排除在基線之外。如果起點2不合適，可以適當增減），終點為10左右。

(2)  閾值（Threshold）線的設定：不同通道的閾值應該分別設定。設定某個通道閾值線時，首先選中含陰性對照的若干個樣品，去掉儀器勾選的自動Threshold線，將其選項“√ Auto"改為“  Auto"，然后手動調整閾值線，以閾值線剛好超過正常陰性對照FAM通道擴增曲線（無規則噪音線）的最高點為準。

4.2 實驗有效性判斷：

陽性對照管：其FAM通道有典型的S型擴增曲線（即指數擴增），其VIC通道的擴增線呈直線或者S型曲線。

陰性對照管：其FAM通道的擴增線呈直線，其VIC通道應該有典型的S型擴增曲線。

如果陽性對照管、陰性對照管同時滿足上述條件，則說明本次實驗結果有效，否則實驗結果無效。

典型的陰性直線型擴增線和陽性S型擴增曲線如圖1所示：

圖1. 典型的陰性直線型擴增線（左）和陽性S型擴增曲線（右）

4.3 待測樣品結果判斷：

待測樣品有可能出現以下4種組合：

表4. 待測樣品管FAM通道和VIC通道可能組合

待測樣品管只要FAM通道有S型擴增曲線（組合1和組合2）就說明有支原體污染。因為外加的內參質粒mycoIC2分子數極少，如果支原體含量很大時，內參質粒的擴增會被抑制，導致內參VIC通道無信號（組合2）。

如果待測樣品管FAM通道呈直線，而VIC通道有S型曲線（說明樣品的DNA提取過程和PCR擴增過程均正常）（由于提取過程中，外加的內參質粒mycoIC2分子數較少，作為內參對照的VIC通道的Ct值會比較大），說明樣品無支原體。

如果陽性對照管和陰性對照管結果正常，而待測樣品管FAM通道和VIC通道均呈直線，說明PCR被抑制。如果樣品是經過提取的，最可能原因是：DNA洗脫前，吸附膜中的乙醇沒有揮發（解決方法：洗脫前，將吸附柱放50-65℃烘箱至少15min）。如果樣品是沒有經過提取的，則樣品本身含有抑制PCR的成分（解決方法：將樣品進行DNA提取或者離心清洗）。

注1:陽性結果需要結合擴增曲線（主要）和Ct值（次要）進行判斷，不能只看Ct值（因熒光值的波動，個別陰性樣品雖然擴增曲線基本呈直線，但可能會出現Ct值，此類樣品不能判斷為陽性。反之亦然：有些樣品有S型曲線，但是因為熒光值波動，導致沒有Ct值，此類樣品不能判斷為陰性）

注2:無論FAM通道，還是VIC通道，只要其擴增曲線有明顯抬升（呈現S型曲線趨勢），即使其Ct值在35-40范圍內，該檢測結果仍可判斷為陽性，可以報告該Ct值。

注3:結果判斷完后，將PCR八聯管用自封袋密閉后，進行適當處理。

注意事項

1.         本產品主要用于細胞上清支原體污染檢測，僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2.         防DNA污染注意事項：

(1)  強烈建議所有操作（特別是qPCR體系配制步驟和吸取試劑盒中試劑的時候）使用濾芯吸頭進行操作，以免試劑被污染。

(2)  必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體。

(3)  樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對照DNA、待測樣品DNA的吸頭，務必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋，以防止陽性DNA的揮發，造成環境的污染，進而造成假陽性。整個操作過程，最好不要說話，因為人的口腔和唾液都是帶支原體的。

(4)  反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的污染。結果判斷完后，將其用自封袋密閉后，進行適當處理。

3.         實驗室必須嚴格分房間操作（本試劑盒建議在有窗戶、通風良好的普通房間內操作，請勿在密閉的房間操作。請勿在細胞培養間進行該步驟的操作，因為細胞培養間支原體污染概率很高）：

試劑配制房間1：專門進行定量PCR體系的配制（建議該房間全部使用進口濾芯吸頭。）

DNA提取房間2：專門進行支原體DNA的提取；

DNA加樣房間3：專門進行定量PCR體系配制后，添加待測樣品、陽性對照、陰性對照等操作；

PCR擴增房間4：進行實時熒光PCR擴增檢測。

注：如果房間緊張，可以考慮將房間2、房間3合并在一個房間，而房間1和房間4必須獨立。各房間物品（包括移液槍）均為專用，不得交叉使用。

4.         如果出現qPCR的擴增被細胞的代謝產物抑制時（qPCR結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線），可以采取以下幾種措施：

(1)  將取樣的時間提前到換液后2 d或3 d，此時細胞上清的PCR擴增抑制物相對比較少，一般不會產生嚴重的抑制。據我們測試，換液后5 d，PCR擴增抑制物就已經大量積累。

(2)  用PBS對待測樣品進行離心清洗，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取1 mL細胞上清，先13000 rpm離心10 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 min，簡單離心（1000 g，5 sec）后，取上清進行檢測。但是該方法有如下缺點：第一，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導致漏檢，因為離心清洗過程中，可能導致支原體部分丟失。第二，個別樣品，即使經過上述清洗也無法去除抑制劑。

(3)  抽提細胞上清的支原體DNA后再進行PCR鑒定。

(4)  使用李記生物的Quick Cell支原體快速檢測試劑盒（細胞培養專用）（貨號：AC16L061）或者Quick Cell 發光法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L062）進行檢測，經測試，未發現這兩種試劑盒會被細胞的代謝產物所抑制。為了預防PCR的擴增被細胞的代謝產物抑制的問題，也可以考慮將所有待測樣品全部進行離心清洗或者DNA提取后，再使用本試劑盒進行檢測。

5.         支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰*、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精*酸和含精*酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7 d后，再進行檢測。具體方法請參考李記生物Quick Cell 發光法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L062）說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7 d，但是可靠性高。

6.         如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰*、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取以下幾種措施：（1）將支原體DNA濃縮提取后再進行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除），大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）對支原體進行離心濃縮：取1 mL細胞上清，先13000 rpm（約16000 g）離心10 min，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 min，簡單離心后（1000 g，5 sec），取上清進行檢測。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20倍。（3）如果樣品是未經提取的，可以通過增加反應管中樣品DNA的加入量，比如由原來的2 μL增加到18 μL，如此可以提高檢測靈敏度9倍（沒有提取純化或者離心清洗的待測樣品，一般不能直接擴大待測樣品體積，否則PCR被抑制的可能性將大幅度增加。）

7.         如發現細胞被支原體污染，推薦使用李記生物的Quick Cell支原體祛除預防試劑盒（貨號：AC16L066）、EZ 水浴鍋抑菌劑（貨號：AC16L162）、EZ 細胞房除菌劑（貨號：AC16L143）。產品詳情可咨銷或見官。

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